細(xì)胞衰老是一種阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的永久性病變過程。其主要由DNA損傷、端粒縮短和功能障礙、致癌和其他類型的細(xì)胞應(yīng)激引起，具體表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)擴(kuò)張、溶酶體pH升高、對生長因子的反應(yīng)性喪失以及細(xì)胞中衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性、活性氧（ROS）水平增加等特征。衰老細(xì)胞的過度積累可引發(fā)多種疾病，如腫瘤、退行性疾病等，因此，β-gal活性的異常積累是研究細(xì)胞衰老的一種重要的生物標(biāo)志物，其主要存在于衰老細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中。目前，商品化的β-gal測試方法是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷（X-gal）測定法，該方法的主要缺點是需將細(xì)胞手動固定在培養(yǎng)皿上并手動計數(shù)、反應(yīng)時間長、檢測靈敏度差等。因此，設(shè)計高靈敏度、實時監(jiān)測的β-gal活性的探針，不僅對探索細(xì)胞衰老相關(guān)的生理過程具有重要意義，而且對β-gal在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要價值。
丁彩鳳教授、張鵬副教授課題組以氰基亞乙烯基染料（BMZ）為熒光團(tuán)，引入電子受體（苯并噻唑）、π-共軛橋（氰基乙烯基）、電子供體（N，N-二乙基苯胺）和β-半乳糖苷鍵，構(gòu)建了一例可用于檢測β-gal活性的比率型熒光探針。該探針結(jié)構(gòu)中的二乙基氨基可使其靶向進(jìn)入細(xì)胞中的溶酶體。探針在470 nm處具有最大吸收，在620 nm處有激基締合物的熒光發(fā)射，與β-gal孵育后，10分鐘內(nèi)其熒光藍(lán)移到533 nm，表明糖苷鍵被去除，并發(fā)生自發(fā)取代，原位產(chǎn)生新的熒光產(chǎn)物。探針于衰老細(xì)胞中的溶酶體共定位實驗展示出較高的共定位系數(shù)，證明了其對溶酶體中β-gal活性檢測的有效性。通過羥基脲和活性氧誘導(dǎo)的PC-12、Hep G2和RAW 264.7細(xì)胞衰老成像研究顯示，該傳感平臺可用于藥物及氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞衰老可視化分析，結(jié)果經(jīng)X-gal試劑法證實。此外，在小鼠模型中連續(xù)注射衰老藥物羥基脲或D-半乳糖5周后，在特定通道中觀察到顯著的熒光變化，因而該探針也能夠?qū)崿F(xiàn)對生物體內(nèi)藥物誘導(dǎo)的機(jī)體衰老的熒光分析。同時，還檢測到了器官水平上細(xì)胞特異性器官和皮膚組織的衰老，證明藥物誘導(dǎo)的大腦、皮膚和肌肉組織衰老最為嚴(yán)重。這些實驗結(jié)果表明該探針在衰老生物醫(yī)學(xué)研究中的具有重要的應(yīng)用價值。
相關(guān)成果以“Ratiometric Fluorescent Probe for Real-Time Detection of β-Galactosidase Activity in Lysosomes and Its Application in Drug-Induced Senescence Imaging”發(fā)表于國際分析化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2024, 96, 7, 3223-3232）。
近日，該團(tuán)隊在上述研究基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種基于三重響應(yīng)機(jī)制的新型熒光傳感分子SA-HCy-1，以具有近紅外熒光發(fā)射的部花菁染料為發(fā)色團(tuán)，通過自消除連接體修飾半乳糖，用于精確跟蹤衰老情況。在較高pH值（pH>6.0）的衰老細(xì)胞溶酶體環(huán)境中，SA-β-gal選擇性水解糖苷鍵，隨后4-羥基芐基鍵自發(fā)進(jìn)行1,6-消除，釋放出713 nm的近紅外熒光，這是卵巢癌細(xì)胞溶酶體衍生的β-gal無法達(dá)到的。花菁骨架上的雙鍵可被衰老細(xì)胞中過表達(dá)的ROS破壞(如ClO-)，生成發(fā)射為青色的產(chǎn)物，提供以468 nm和713 nm為中心的比例熒光，準(zhǔn)確反映細(xì)胞衰老程度。得益于SA-β-gal、pH和ROS三個維度的全面控制，探針SA-HCy-1能夠高精度地跟蹤衰老過程。通過阿霉素誘導(dǎo)及多次傳代RAW 264.7細(xì)胞衰老成像研究顯示，該傳感平臺可用于藥物誘導(dǎo)及自然衰老引發(fā)的細(xì)胞衰老可視化分析，結(jié)果經(jīng)X-gal試劑法證實且表現(xiàn)出了更好的性能。值得一提的是，該探針在小鼠皮膚光衰老模型進(jìn)一步進(jìn)行了實際應(yīng)用，該研究表明探針SA-HCy-1可用于評估皮膚衰老程度和防曬產(chǎn)品的工作效率。
該研究成果近期以 “A near-IR ratiometric fluorescent probe for the precise tracking of senescence: a multidimensional sensing assay of biomarkers in cell senescence pathways”為題發(fā)表于化學(xué)領(lǐng)域頂級期刊Chemical Science上，文章的第一作者是2020級碩士研究生劉海紅，通訊作者是張鵬副教授、張倩副教授和丁彩鳳教授。該研究得到國家自然科學(xué)基金（22004078, 22074074和 21904077）、山東省自然科學(xué)基金面上項目（ZR2020MB065）、山東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2022KJC004）和青島市自然科學(xué)基金（23-2-1-175-zyydjch）的資助支持。
論文信息：Chemical Science（Chem. Sci., 2024, DOI: 10.1039/D4SC00595C）
